我们通常需要做基因或者其它DNA片段的定点突变来研究其功能，所以做好定点突变是分子生物学中的一项重要技术。今天，我将分享我自己做定点突变的经验，主要有两种方法，供大家参考。

定点突变技术

定点突变技术 (Site-directed, Ligase-IndependentMutagenesis, SLIM) (Chiuet al., 2004) 原理如下图1所示。无论是进行插入突变、缺失突变、还是定点突变，原理都是一样的。

以插入突变为例（图1 A），设计四条引物，并且在引物RT和FT的5位置引入插入片段，然后在同一个反应体系中以质粒模板（已插入有待改造的基因片段）进行PCR，则会产生四种PCR产物；让产物进行变性和退火，在四种PCR产物中，只有产物1和产物2能因为退火而重新形成环状双链的质粒；最后，在混合物中加入Dpn I酶，则模质粒全部被消化掉（大肠杆菌中提取的模板质粒，具有甲基化修饰，故被Dpn I消化掉），而已经被改造成功的双链环状质粒则不会被消化（PCR扩增的DNA序列均没有甲基化修饰）；把消化后的产物转化大肠杆菌感受态细胞，在抗性压力下筛选出所需要的已经被改造了的质粒。

同理，图1 B中所显示的是缺失突变的原理，只需要在设计引物时，在所要缺失的片段的两端设计四条引物，用同样的方法进行实验操作即可；而在图1 C中的原理则是定点突变技术，在引物中引入所需要改变的序列即可。

图1 点突变技术原理图 (Chiuet al., 2004)

Fig. 1 Representation of SLIM. The gene-specific portion of each primer is denoted by arrows.

Forward and reverse primers are shown in grayand black, respectively. The hash line represents

the 5-adapter of the tailed primer (Chiuet al., 2004).

(A) Sequence insertion. (B) Sequence deletion. (C) Sequence exchange (mutagenesis).

具体实验方法如下：

1.以XX质粒为模板进行PCR 反应，PCR 反应体系如下：

依次加入上述成分，混匀，短时离心。

按以下条件进行PCR 反应：第一阶段：98 ℃ 2min，1 个循环；第二阶段：98 ℃ 15 sec，55 ℃ 60 sec，68 ℃ 2.5 min，共35 个循环；第三阶段：68 ℃延伸7 min；最后4 ℃保存。

2. 把点突变的PCR 产物直接进行Dpn I 消化：

Dpn I 消化反应体系如下：

酶切反应条件：37℃水浴3 h或至过夜。

3.将消化后的产物全部转移至新的PCR 管中，进行如下反应：

第一阶段：99 ℃ 3min，1 个循环；第二阶段：65 ℃ 5 min，30 ℃ 15 min，共2 个循环，最后把产物真空干燥浓缩至10 μl 左右取浓缩后的产物进行转化。在抗性筛选平板上面挑取单菌落送测序及酶切鉴定。

Overlap PCR（重叠延伸PCR）

用重叠延伸PCR做定点突变，采用重叠引物延伸PCR介导做定点突变实际上是一种快速高效的在基因中特定位点引入特定突变的有效技术。其基本原理就是采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成了一小段的重叠链, 然后在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来。

该技术主要包括以下几步：

(1) 设计引物，PCR扩增基因两端

(2) 回收两端片段

(3) 两端片段退火延伸，扩增全长基因

1. 引物设计

重叠延伸PCR做定点突变引物的设计

引物F及R为基因两端特异引物，其中Fm及Rm为中间引物。其中引物Fm及Rm中间共享一段序列（至少10bp完全匹配），* 为突变点，突变点最好是位于引物的5’端，尽量避免出现在3’端。然后分别用引物F和Rm及Fm和R进行配对进行PCR。该步一定要用pfu酶，不能用Taq酶，因为Taq酶容易在PCR产物末端加A，会造成产物移码突变。

2. 分别回收第1步所得两条PCR产物

3. 将第2步所得两份PCR产物进行混合使其互为模板及引物，加入dNTP及Pfu或Taq酶及引物F和R进行PCR扩增出具有突变的全基因。

具体实验方法如下：

第一步：PCR 扩增出缺失片段的上下游片段，PCR 反应体系如下：

PCR 反应条件：94℃，5 min，1 个循环；94℃，30 sec，55℃，30 sec，72℃，

1 kb/min，30 个循环；72℃延伸10 min；12℃保存。

PCR 产物跑琼脂糖凝胶电泳，胶回收目的片段。

第二步：PCR，不需要加入引物，目的是将上步骤所得的上下游胶回收片段连接起来以作为下步反应的模板.

PCR 反应体系如下：

PCR 反应条件：94℃，5 min，1 个循环；94℃，30 sec，53℃，30 sec，72℃，

1 min，4 个循环；72℃延伸10 min；12℃保存。

第三步：PCR，把第二步的PCR 产物作为模板进行普通的PCR反应扩增出截短型的目的片段。

PCR 反应体系：向第二步PCR 产物中加入缺失型目的片段的上下游引物各2 μl。

PCR 反应条件：94℃，5 min，1 个循环；94℃，30 sec，55℃，30 sec，72℃，

1 kb/min，30 个循环；72℃延伸10 min；12℃保存。

第四步：将上步PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳，胶回收，即可连接相关载体。需要注意的是，此步所得的胶回收产物是没有加A尾的，是平末端产物，如需加A 尾，步骤同上。

参考文献：

Ge L , Rudolph P . Simultaneous introduction of multiple mutations using overlap extension PCR[J]. Biotechniques, 1997, 22(1):28-30.

Joyce C , March P E , Ryan L , et al. Site-directed, Ligase-Independent Mutagenesis (SLIM): a single-tube methodology approaching 100% efficiency in 4 h[J]. Nucleic Acids Research, 2004(21):174-0.

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